大鼠甲胎蛋白(AFP)ELISA 檢測(cè)試劑盒 本試劑僅供研究使用 標(biāo)本:血清或血漿 試驗(yàn)原理: AFP試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA).已知AFP濃度的標(biāo)準(zhǔn)品、未知濃度的樣品加入微孔酶標(biāo)板內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。先將AFP和生物素標(biāo)記的抗體同時(shí)溫育。洗滌后,加入親和素標(biāo)記過的HRP。再經(jīng)過溫育和洗滌,去除未結(jié)合的酶結(jié)合物,然后加入底物A、B,和酶結(jié)合物同時(shí)作用。產(chǎn)生顏色。顏色的深淺和樣品中AFP的濃度呈比例關(guān)系。 試劑盒內(nèi)容及其配制 試劑盒成份(2-8℃保存) | 96孔配置 | 48孔配置 | 配制 | 96/48人份酶標(biāo)板 | 1塊板(96T) | 半塊板(48T) | 即用型 | 塑料膜板蓋 | 1塊 | 半塊 | 即用型 | 標(biāo)準(zhǔn)品:400ug/L | 1瓶(0.6ml) | 1瓶(0.3ml) | 按說(shuō)明書進(jìn)行稀稀 | 空白對(duì)照 | 1瓶(1.0ml) | 1瓶(0.5ml) | 即用型 | 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋緩沖液 | 1瓶(5ml) | 1瓶(2.5ml) | 即用型 | 生物素標(biāo)記的抗AFP抗體 | 1瓶(6ml) | 1瓶(3.0ml) | 即用型 | 親和鏈酶素-HRP | 1瓶(10ml) | 1瓶(5.0ml) | 即用型 | 洗滌緩沖液 | 1瓶(20ml) | 1瓶(10ml) | 按說(shuō)明書進(jìn)行稀釋 | 底物A | 1瓶(6.0ml) | 1瓶(3.0ml) | 即用型 | 底物B | 1瓶(6.0ml) | 1瓶(3.0ml) | 即用型 | 終止液 | 1瓶(6.0ml) | 1瓶(3.0ml) | 即用型 | 自備材料 1. 蒸餾水。 2. 加樣器:5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。 3. 振蕩器及磁力攪拌器等。 安全性 1. 避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體,請(qǐng)盡快用水沖洗。 2. 實(shí)驗(yàn)中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。 3. 不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。 操作注意事項(xiàng) 1. 試劑應(yīng)按標(biāo)簽說(shuō)明書儲(chǔ)存,使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄,不可保存。 2. 實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中,密封保存,以免變質(zhì)。 3. 不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號(hào)的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。 4. 使用一次性的吸頭以免交叉污染,吸取終止液和底物A、B液時(shí),避免使用帶金屬部分的加樣器。 5. 使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。 6. 洗滌酶標(biāo)板時(shí)應(yīng)充分拍干,不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水。 7. 底物A應(yīng)揮發(fā),避免長(zhǎng)時(shí)間打開蓋子。底物B對(duì)光敏感,避免長(zhǎng)時(shí)間暴露于光下。避免用手接觸,有毒。實(shí)驗(yàn)完成后應(yīng)立即讀取OD值。 8. 加入試劑的順序應(yīng)一致,以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時(shí)間一樣。 9. 按照說(shuō)明書中標(biāo)明的時(shí)間、加液的量及順序進(jìn)行溫育操作。 樣品收集、處理及保存方法 1、 血清-----操作過程中避免任何細(xì)胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液后,1000×g離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。 2、 血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測(cè)。1000×g離心30分鐘去除顆粒。 3、 細(xì)胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。 4、 保存------如果樣品不立即使用,應(yīng)將其分成小部分-70 ℃保存,避免反復(fù)冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒,檢測(cè)前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。 試劑的準(zhǔn)備 1. 標(biāo)準(zhǔn)品:標(biāo)準(zhǔn)品的系列稀釋應(yīng)在實(shí)驗(yàn)時(shí)準(zhǔn)備,不能儲(chǔ)存。稀釋前將標(biāo)準(zhǔn)品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進(jìn)行: 400 ug/L | (6號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品) | 原倍濃度不用稀釋直接加入50ul。 | 200 ug/L | (5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品) | 100ul的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 | 100 ug/L | (4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品) | 100ul的5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 | 50 ug/L | (3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品) | 100ul的4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 | 25 ug/L | (2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品) | 100ul的3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 | 12.5 ug/L | (1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品) | 100ul的2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 | 0 ug/L | (空白對(duì)照) | 原始濃度不用稀釋直接加入50ul。 | 2. 洗滌緩沖液(50×)的稀釋:蒸餾水50倍稀釋。 操作步驟 1. 使用前,將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫,以免加樣時(shí)加入大量的氣泡,產(chǎn)生加樣上的誤差。 2. 根據(jù)待測(cè)樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔。每個(gè)樣品根據(jù)自己的數(shù)量來(lái)定,能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。 3. 加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50ul于反應(yīng)孔、加入待測(cè)樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50ul的生物素標(biāo)記的抗體。蓋上膜板,輕輕振蕩混勻,37℃溫育1小時(shí)。 4. 甩去孔內(nèi)液體,每孔加滿洗滌液,振蕩30秒,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機(jī)洗滌,洗滌次數(shù)增加一次。 5. 每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP,輕輕振蕩混勻,37℃溫育30分鐘。 6. 甩去孔內(nèi)液體,每孔加滿洗滌液,振蕩30秒,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機(jī)洗滌,洗滌次數(shù)增加一次。 7. 每孔加入底物A、B各50ul,輕輕振蕩混勻,37℃溫育10分鐘。避免光照。 8. 取出酶標(biāo)板,迅速加入50ul終止液,加入終止液后應(yīng)立即測(cè)定結(jié)果。 9. 在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。 建議使用的實(shí)驗(yàn)方案 | 標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ug/L) | | A | 400 | 400 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | B | 200 | 200 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | C | 100 | 100 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | D | 50 | 50 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | E | 25 | 25 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | F | 12.5 | 12.5 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | G | 0 | 0 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | H | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 局限 6號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品以上的結(jié)果為非線性的,根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線無(wú)法得到的結(jié)果。 試劑盒性能 1. 靈敏度:zui小的檢測(cè)濃度小于1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990。 2. 特異性:不與其它細(xì)胞因子反應(yīng)。 3. 重復(fù)性:板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%。 結(jié)果 判 斷 與 分 析 1、儀器值:于波長(zhǎng)450nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD值 2、以吸光度OD值為縱坐標(biāo)(Y),相應(yīng)的AFP標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)(X),做得相應(yīng)的曲線,樣品的AFP含量可根據(jù)其OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度。 3、檢測(cè)值范圍:0-400ug/L 4、敏感度: 1.0 ug/L |